3D细胞和类器官.

3D 细胞培养可以在以下方面弥补体外和体内实验研究之间的差距：

• 提高临床前实验分析的效率和数据质量
• 提高解读癌症等疾病的可能性
• 与2D细胞培养相比，为开发和个性化医疗提供更多药物反应数据
• 减少对动物实验的依赖

3D细胞培养技术发展迅猛，开发者众多，这导致术语使用不一致。阐明术语有助于解决该问题。(²) 由于贴壁细胞趋向于聚集的特性而形成的球体类细胞被作为简单的 3D 模型广泛使用，并且可以由许多不同类型的细胞生成。类器官是更复杂的 3D 聚合体，类似于微型化和简化版的器官。它们可能来源于组织或由干细胞衍生，在空间上能够有序排列并具备器官的特异性功能。(³)

支持3D 细胞培养的模式如下(⁴) 包括：

• 非锚定依赖性（不以支架为基础）：悬滴、低吸附板、微图案板
• 锚定依赖性：生物水凝胶（例如 Matrigel(R)，胶原蛋白）或合成水凝胶
• 类器官芯片

值得注意的是，目前尚无任何金标准技术。最优的3D 细胞培养方式取决于众多因素，包括：

• 细胞系和细胞来源（永生细胞、原代细胞、诱导多能干细胞、组织外植体）
• 预期的待建模生物学复杂性/相关性水平
• 通量要求
• 成本
• 实验的可重复性

锚定依赖性模型具有极高的可扩展性、经济性和可重复性，是颇受欢迎的简单球体细胞培养模型。然而，该模型缺乏与细胞外基质之间的相互作用，这限制了其在某些方面的应用。

锚定依赖性培养无需专用培养板，可同时适用于支持简单和复杂的 3D 细胞培养模型。例如 ，Matrigel ® 或胶原蛋白之类的动物来源性的支架，能够为体内实验的细胞提供机械和物理固定。

然而，一些批评指出，动物来源性水凝胶的成分存在不同批次间的差异，并且源自癌细胞培养物的水凝胶并不能体现生物因子的健康生理水平。另一方面，合成支架虽然不受批次间差异的影响，但缺乏支持正常细胞粘附、生长和分化所需的部分属性。 (²)

类器官芯片形式可支持复杂且高度专业化的 3D 细胞培养物的生长，这些细胞培养物模拟了器官的功能和复杂性。它们由可供（嵌入）细胞生长的微流体通道和液体灌注通道组成。

目前已出现商业化的类器官芯片技术，但大部分仍处于内部研发阶段。现阶段，芯片的高成本使得该技术无法广泛应用于高通量筛选，但正被越来越多地应用于研发和小规模筛选。

目前3D细胞培养的适用领域包括：

• 基础研究
• 药物开发
• 个性化医疗

随着研究人员从 2D 细胞培养转向 3D 细胞培养，在细胞系的选择上也出现了类似的趋势。如今，原代细胞、诱导多能干细胞和共培养细胞比永生细胞系更受青睐。

基因组学在 3D 细胞培养应用中发挥着越来越重要的作用。CRISPR-Cas9 等基因组编辑技术为科学家在研究突变对疾病进程的影响时提供了工具。此外，二代测序技术（NGS）也有助于人们深入了解癌症等疑难病症的复杂构成（通常具有异质性）。

3D细胞培养应用于基础研究和疾病模型建立

3D细胞培养被广泛用于基础研究和癌症等疾病模型建立。(⁵)

通过20多年的研究，我们已经取得了充分的证据，这些证据揭示了肿瘤微环境（TME）在癌症发展和进程中的关键作用。在二维 (2D) 细胞培养系统中，细胞在平整的固体表面上以单层形式生长，缺乏原发肿瘤的特性，即细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。这些 2D 培养的细胞被拉伸并经历细胞骨架重排，获得人工极性，进而导致基因和蛋白表达的异常。相比之下，3D 培养系统可以在空间上单独培养肿瘤细胞或将各类细胞混杂在一起培养肿瘤胞，这更有利于细胞 – 细胞和细胞 – 基质相互作用，从而更好地模拟肿瘤的天然环境。这些相互作用导致 3D 培养细胞具备反映体内肿瘤形态和细胞特征的能力。

基于这些优势，研究人员使用肿瘤球体来研究癌症生物学中涉及的各种机制，包括：

• 代谢和缺氧诱导的变化
• 肿瘤细胞浸润和迁移
• 肿瘤干细胞
• 肿瘤微环境信号偶联

除肿瘤领域外，3D细胞培养还被用于基础研究的其他领域，包括：

• 神经退行性疾病的研究(⁶)
• 体外血脑屏障(⁷)模型的开发
• 胰腺类器官，可能作为胰腺癌和糖尿病的模型(⁸)
• 肠类器官，作为囊肿性纤维化模型(⁹)

3D细胞培养用于药物开发

大多数潜在的候选药物都无法通过临床试验（80%），这一数字在肿瘤药物的比例甚至更高。 (¹⁰) 失败的最常见原因是缺乏疗效，但仍有高达17% 的 3 期临床试验由于安全问题而失败。 (¹¹)

3D 细胞培养已成为临床前药物研发各个阶段（从疾病建模、靶点识别和验证到筛选、先导药物的选择、药物有效性和安全性评估）十分有价值的工具。研究人员经常在模型预测的价值和成本、设置的难易程度和通量之间进行权衡。由于自动化3D细胞培养模型的成本、复杂性和难度较大，通常只在适度通量下展开药物筛选，一般不超过100,000种化合物。事实上，大规模药筛尚未在 3D 细胞中进行，但可以使用 3D 模型验证药敏药效和药物毒性。 如果使用的化合物数量较少，使用更先进的模型或类器官芯片技术便成为可能。

在药物开发过程中，化合物在进入临床阶段之前必须经过严格的安全性测试。临床前安全性评估包括体外试验（生化和传统的 2D 细胞培养分析）和后续的动物试验。

3D 细胞培养尚未达到可以取代动物毒性测试的阶段，但考虑到高成本、伦理问题以及动物与人类之间的生理差异，3D细胞培养可发展为极具前景的另一选择。用于检测肝毒性(¹²)和心脏毒性(¹³)的新型3D细胞培养模式的开发推动了这一进程。 然而，尚无充分的证据显示这些方法可以改善动物试验的生理相关性。另一方面，在解释免疫和心血管系统上是否仍然缺乏复杂性值得探究(¹³)。

尽管在将3D细胞培养应用于药物开发，尤其在用于高通量筛选时面临诸多挑战，但通过与更优化的细胞模型（例如干细胞和原代细胞）联合使用，3D细胞培养能够更好地预测药物在进入临床试验之前的体内药效和毒性，而这反过来可降低正在开发中的新型分子药物的损耗率。

3D细胞培养用于个性化医疗

分子靶向治疗能够持续改善许多癌症患者的状况。众所周知，患者之间存在显著的肿瘤异质性，甚至同一种肿瘤的患者之间也存在显著的异质性。这些异质性限制了靶向治疗对特定亚型患者的疗效，并最终导致复发。 (¹⁴)

肿瘤的基因检测在临床中已经司空见惯，主要用于识别癌症亚型并指导靶向治疗。 然而，许多癌症会发生大量基因型和表型的变化，而我们缺乏对基因型-表型关系的深入理解。因此，需要补充方案来指导治疗。 (¹⁴)

患者来源的类器官虽保留了原始肿瘤的异质性，但允许在体外检测不同药物或药物组合的疗效。 “患者来源性类器官模型药物筛选”尚未得到充分验证可作为临床预测性生物标志物。因此，需要更多的研究和开发来标准化患者衍生的类器官并完善模型。可建立癌症生物样本库，提供获取相关细胞的途径，这将有助于实现该目标。在未来，我们可能会看到将源自患者的类器官和基因检测作为指导个性化医疗的补充工具。 这一富有前景的发展将有望提高药物治疗效果，并最大限度地减少毒副作用。(¹⁵)

3D 细胞培养技术已经进入制药和学术领域，并被越来越多地应用于个性化医疗。随着3D细胞培养板、芯片和专门的细胞系的市场化，以及生物样本库资源的开放，越来越多的受众可获取到相关技术。在制药领域，肿瘤学仍然是3D细胞培养技术和方法最常见的应用方向。此外，在学术界，它们也被广泛地应用于各种研究领域。

3D细胞培养应用难点主要存在于以下两个方面(³)：

• 3D 细胞培养模型的科学验证及其预测药敏药效能力的量化
• 以下方面相关的过程和技术挑战：实验方法的标准化、通量的增加、分析管线的开发，以及如何持续降低成本。

3D细胞培养模型的验证

大量研究表明，2D 和 3D 细胞培养会产生不同的药物反应，目前尚不清楚3D细胞培养反映疾病生物学的具体精准度。2D和3D细胞培养模型对疾病的预测价值将有助于确定药物成功干预后的表型变化指针。在获得此类数据之前，3D细胞培养将继续与2D细胞培养和生化分析相辅相成。表型模型的金标准必将出现，但目前尚未就此达成科学共识。其次是监管问题。随着表型筛选方法的复兴，目标反卷积对于获得监管批准至关重要。目前，3D培养细胞的毒理学实验尚不能完全取代动物试验。无论如何，它们作为一种支持性方法具有潜在的应用价值，能够在药物研发周期中更早的淘汰毒理学结果较差的化合物，从而最大程度地减少实验动物的使用。

过程中的挑战

成本
由于需要专门的细胞、试剂（基底膜提取液）和耗材（专用板或芯片），3D细胞培养应用的成本显著高于2D细胞培养应用。

标准化和可重复性
起始物料的高度生物学差异性和标准方法的缺乏导致实验的可重复性较低。

由于敏感细胞和对温度敏感的试剂并不直接适合自动化，高通量将难以实现。虽然在不依赖锚定的培养模型中进行简单的球状体检测相对容易实现自动化，但对于类器官而言难度要大得多，因为它们依赖于温度敏感性材料，如Matrigel ® 或器官芯片结构。 类器官培养需要具有严格的定位精度和温度控制以实现精准的液体处理。 在大多数情况下，高通量培养模型仍仅限于 96或384 微孔板。

材料的缺乏普遍存在，因为可获取的原代或患者来源的细胞通常数量有限。 为获得用于一次筛选的足量细胞，往往需要几周甚至数月。

分析流程也存在问题。虽然一些简单的全孔实验分析读数（例如ATP定量实验）并不难，但只有在多参数表型分析后才能获得最全面的结论，并利用复杂的细胞反应模式对化合物药效进行分类。这需要高内涵成像和分析流程、小生境技术和足够的执行时间，因此限制了与某些 3D 细胞培养模型的兼容性。 (²)

实现类器官处理的自动化一直以来都具有挑战性，原因包括支持这些模型的细胞供应有限、传统移液工作站和分液器的死体积过大且难以处理粘稠的基底膜提取物。此外，高度可重复的 3D 细胞培养也较为困难。(16) 鉴于许多 3D 细胞培养应用的通量不大，手动移液仍然是许多实验室的常规做法。

基于固相置换原理的桌面式分液器显著提高了 3D 细胞培养设置过程效率，并实现了工作流程的标准化，以获得更可靠数据。

以固相置换为原理的分液器使活塞直接与注射器内的液体接触，因此没有空气柱和液体。这种方法是处理Corning Matrigel ®等粘稠试剂的理想选择，具有高准确性和高精度。(¹⁷)

SPT Labtech的dragonfly® discovery 等系统实现了低至 200 nL以上的准确分液，从而能够有效实现实验体系微缩化。这不仅能够降低试剂和特殊细胞的成本，而且还能从容应对起始材料（例如患者来源的细胞）稀缺的情况。它的死体积较低，仅为30 uL；这样，用户便能够设置比手动移液或传统分液方法更多的重复实验。速度和温度控制对于ECM制剂（如 Matrigel ® 或 Cultrex）处理至关重要。从速度上来看，非接触式分液同样非常适合，因为注射器能够在Matrigel ®升温凝固之前快速（不到1分钟）完成一个96孔板的分液。如果需要多板分液，则辅助的被动冷却模块可以使试剂在一定时间内保持在低温状态。

自动化使得用户能够标准化 3D 细胞培养设置，因此，唯一的检测变量是靶向介入（药物、基因组扰动、RNA 敲除）和输入细胞群的异质性。由于需要进行高内涵分析，那么能够在板或芯片的预设位置进行精准分液的分液器便具有极大优势，因为它可以减少高内涵分析所需要覆盖的成像区域。这既适用于2D细胞培养表型分析，同时对需要z轴多层扫描的3D图像更为重要。

使用dragonfly® discovery等桌面式分液器可极大简化 3D 细胞培养的操作设置，但用户仍然需要考虑培养维护，例如，更换细胞培养基以进行长期培养。 ECM 中的类器官培养物非常脆弱，标准洗板机设置过于苛刻和不精确，无法完全去除培养基。 移液工作站可能是一个替代方案，但是他们依赖于使用一次性移液枪头，而此项花费甚高。因此，一些研究人员倾向于在类器官内使用磁珠，这样便能够在吸出或补充培养基时将类器官转移到孔板上的安全位置。

3D 细胞培养应用越来越受青睐，我们预计这种趋势仍将持续数年。 (18) 目前，3D 细胞培养模型的优势与成本、通量和可用性之间仍然需要权衡。鉴于自动化有助于显著降低3D细胞培养应用的障碍，研究人员可针对具体的问题自行选择最合适的实验模型。

我们预计在不久的将来，采用球体和类器官模型应用于药物研发领域（包括筛选）以及转化医学应用进入临床实践的情况会有所增加。 3D 细胞培养的最大优势之一是表型分析提供的多参数分析。 研究人员已经利用基因组干扰 (CRISPR-Cas 9/RNAi) 来模拟和理解疾病生物学。 我们希望看到 NGS 技术越来越频繁地与 3D 细胞培养技术结合使用。

随着科学家们不断开发新技术来优化 3D 细胞培养工作流程，该领域的研究前景一片光明。

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